利用紫外-可見(jiàn)吸收光譜來(lái)進(jìn)行定量分析由來(lái)已久，可追溯到古代，公元60年古希臘已經(jīng)知道利用五味子浸液來(lái)估計(jì)醋中鐵的含量，這一古老的方法由于最初是運(yùn)用人眼來(lái)進(jìn)行檢測(cè)，所以又稱比色法。到了16、17世紀(jì)，相關(guān)分析理論開始蓬勃發(fā)展，1852年，比爾(Beer)參考了布給爾(Bouguer)1729年和朗伯(Lambert)在1760年所發(fā)表的文章，提出了分光光度的基本定律，即液層厚度相等時(shí)，顏色的強(qiáng)度與呈色溶液的濃度成比例，從而奠定了分光光度法的理論基礎(chǔ)，這就是著名的朗伯-比爾定律。
　　
　　儀器形成
　　
　　吸光光度法也稱做分光光度法，但是分光光度法的概念有些含糊，分光光度是指儀器的功能，即儀器進(jìn)行分光并用光度法測(cè)定，這類儀器包括了分光光度計(jì)與原子吸收光譜儀(AAS)。吸光光度法的本質(zhì)是光的吸收，因此稱吸光光度法比較合理，當(dāng)然，稱分子吸光光度法是最確切的。
　　
　　紫外-可見(jiàn)吸收光譜是物質(zhì)中分子吸收200-800nm光譜區(qū)內(nèi)的光而產(chǎn)生的。這種分子吸收光譜產(chǎn)生于價(jià)電子和分子軌道上的電子在電子能級(jí)躍遷(原子或分子中的電子，總是處在某一種運(yùn)動(dòng)狀態(tài)之中。每一種狀態(tài)都具有一定的能量，屬于一定的能級(jí)。這些電子由于各種原因(如受光、熱、電的激發(fā))而從一個(gè)能級(jí)轉(zhuǎn)到另一個(gè)能級(jí)，稱為躍遷。)當(dāng)這些電子吸收了外來(lái)輻射的能量就從一個(gè)能量較低的能級(jí)躍遷到一個(gè)能量較高的能級(jí)。因此，每一躍遷都對(duì)應(yīng)著吸收一定的能量輻射。具有不同分子結(jié)構(gòu)的各種物質(zhì)，有對(duì)電磁輻射顯示選擇吸收的特性。吸光光度法就是基于這種物質(zhì)對(duì)電磁輻射的選擇性吸收的特性而建立起來(lái)的，它屬于分子吸收光譜。躍遷所吸收的能量符合波爾條件：
　　
　　一 應(yīng)用范圍
　　
　　紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)可用于物質(zhì)的定量分析、結(jié)構(gòu)分析和定量分析。而且還能測(cè)定某些化合物的物理化學(xué)參數(shù)，如摩爾質(zhì)量、配合物的配合比例和穩(wěn)定常熟、酸堿電離常數(shù)等。
　　
　　1.定性分析
　　
　　緊外-可見(jiàn)分光光度法對(duì)無(wú)機(jī)元素的定性分析應(yīng)用較少，無(wú)機(jī)元素的定性分析可用原子發(fā)射光譜法或化學(xué)分析的方法。在有機(jī)化合物的定性鑒定和結(jié)構(gòu)分析中，由于紫外-可見(jiàn)光譜較簡(jiǎn)單，特征性不強(qiáng)，因此該法的應(yīng)用也有一定的局限性。但是它適用于不飽和有機(jī)化合物。尤其是共軛體系的鑒定，以此推斷未知物的骨架結(jié)構(gòu)。此外，可配合紅外光譜、核磁共振波譜法和質(zhì)譜法進(jìn)行定性鑒定和結(jié)構(gòu)分析，因此它仍不失為是一種有用的輔助方法。
　　
　　一般有兩種定性分析方法，比較吸收光譜曲線和用經(jīng)驗(yàn)規(guī)則計(jì)算最大吸收波長(zhǎng)λmax，然后與實(shí)測(cè)值進(jìn)行比較。
　　
　　2.結(jié)構(gòu)分析
　　
　　結(jié)構(gòu)分析可用來(lái)確定化合物的構(gòu)型和構(gòu)象。如辨別順?lè)串悩?gòu)體和互變異構(gòu)體。
　　
　　3.定量分析
　　
　　紫外-可見(jiàn)分光光度定量分析的依據(jù)是Lambert-Beer定律，即在一定波長(zhǎng)處被測(cè)定物質(zhì)的吸光度與它的溶度呈線性關(guān)系。應(yīng)此，通過(guò)測(cè)定溶液對(duì)一定波長(zhǎng)入射光的吸光度可求出該物質(zhì)在溶液中的濃度和含量。種常用的測(cè)定方法有：?jiǎn)谓M分定量法、多組分定量法、雙波長(zhǎng)法、示差分光光度法和導(dǎo)數(shù)光譜法等。

　4.配合物組成及其穩(wěn)定常數(shù)的測(cè)定
　　
　　測(cè)量配合物組成的常用方法有兩種：摩爾比法(又稱飽和法)和等摩爾連續(xù)變化法(又稱Job法)。
　　
　　5.酸堿離解常數(shù)的測(cè)定
　　
　　光度法是測(cè)定分析化學(xué)中應(yīng)用的指示劑或顯色劑離解常數(shù)的常用方法，該法特別適用于溶解度較小的弱酸或弱堿。
　　
　　二 分類
　　
　　紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)的類型很多，但可歸納為三種類型：?jiǎn)喂馐止夤舛扔?jì)、雙光束分光光度計(jì)和雙波長(zhǎng)分光光度計(jì)。
　　
　　1.單光束分光光度計(jì)
　　
　　其光路示意圖如前圖(紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)的基本結(jié)構(gòu)圖)所示，經(jīng)單色器分光后的一束平行光，輪流通過(guò)參比溶液和樣品溶掖，以進(jìn)行吸光度的測(cè)定。這種類型的分光光度計(jì)結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，操作方便，維修容易，適用于常規(guī)分析。國(guó)產(chǎn)722型，751型、724型、英國(guó)SP500型以及BackmanDU-8型等均屬于此類光度計(jì)。
　　
　　2.雙光束分光光度計(jì)
　　
　　其光路示意如下圖所示，經(jīng)單色器分光后經(jīng)反射鏡(M1)分解為弧度相等的兩束光，一束通過(guò)參比池，另一束通過(guò)樣品池。光度計(jì)能自動(dòng)比較兩束光的強(qiáng)度，此比值即為試樣的透射比，經(jīng)對(duì)數(shù)變換將它轉(zhuǎn)換成吸光度并作為波長(zhǎng)的函數(shù)記錄下來(lái)。雙光束分光光度計(jì)一般都能自動(dòng)記錄吸收光譜曲線。由于兩束光同時(shí)分別通過(guò)參比池和樣品他，還能自動(dòng)消除光源強(qiáng)度變化所引起的誤差。這類儀器有國(guó)產(chǎn)710型、730型和740型，日立220系列，島津-210，英國(guó)UNICAMSP-700等等。
　　
　　3.雙波長(zhǎng)分光光度計(jì)
　　
　　其基本光路如下圖所示。由同一光源發(fā)出的光被分成兩束，分別經(jīng)過(guò)兩個(gè)單色器，得到兩束不同波長(zhǎng)的單色光;再利用切光器使兩束光以一定的頻率交替照射同一吸收池，然后經(jīng)過(guò)光電倍增管和電子控制系統(tǒng)，最后由顯示器顯示出兩個(gè)波長(zhǎng)處的吸光度差值ΔA(ΔA=A1-A2)。
　　
　　雙波長(zhǎng)分光光度計(jì)的優(yōu)點(diǎn)：對(duì)于多組分混合物、混濁試樣(如生物組織液)的分析，以及存在背景于擾或共存組分吸收干擾的情況下，利用雙波長(zhǎng)分光光度法，往往能提高方法的靈敏度和選擇性。利用雙波長(zhǎng)分光光度計(jì)，能獲得導(dǎo)數(shù)光譜。通過(guò)光學(xué)系統(tǒng)轉(zhuǎn)換，使雙波長(zhǎng)分光光度計(jì)能很方便地轉(zhuǎn)化為單波長(zhǎng)工作方式。如果能在兩波長(zhǎng)處分別記錄吸光度隨時(shí)間變化的曲線，還能進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)研究。