據(jù)悉，來自美國國家標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)研究院（NIST）和弗吉尼亞聯(lián)邦大學(xué)（VCU）的研究人員現(xiàn)已開發(fā)出一種基于激光納米孔快速加熱方法測(cè)量來監(jiān)控分子進(jìn)出納米孔時(shí)能量的自由分布。該研究成果2021年4月21日Science Advances上。

納米多孔系統(tǒng)中聚合物能量學(xué)的研究始于1970年代，當(dāng)時(shí)研究的是大分子在其他納米多孔材料中分配給沸石和凝膠的分配系數(shù)。這催生了對(duì)受限聚合物鏈的靜態(tài)和動(dòng)態(tài)特性的理論研究。這項(xiàng)工作的重點(diǎn)是應(yīng)用定標(biāo)律來理解孔內(nèi)擴(kuò)散系數(shù)和聚合物分配系數(shù)，這兩者都可以使用使用大量多孔材料來測(cè)量分子的整體性質(zhì)的技術(shù)進(jìn)行研究。盡管這些集成方法提供了對(duì)聚合物-孔隙相互作用的重要見解，但單分子納米孔傳感技術(shù)的出現(xiàn)為更基礎(chǔ)的研究聚合物-孔動(dòng)力學(xué)提供了平臺(tái)。

使用?？?普朗克方程(Fokker-Plank方程)和聚合物理論的詳細(xì)分析，可以在聚合物孔隙動(dòng)力學(xué)與聚合物逸出納米孔的自由能壘之間建立聯(lián)系。之前有大量報(bào)告研究了聚合物納米孔的相互作用，提供了潛在井的詳細(xì)粗粒度模型和化學(xué)特異的分析模型。限制在納米孔中的聚合物自由能的最全面模型包括來自排除的體積效應(yīng)的勢(shì)能、分子間鍵的振動(dòng)模式、外部電場(chǎng)和靜電相互作用。進(jìn)一步的擴(kuò)展還包括聚合物與溶劑和電解質(zhì)成分的相互作用，這提供了對(duì)中空聚合物在納米孔中模擬電壓依賴性效應(yīng)的能力。

盡管大多數(shù)研究都討論了熵是自由能壘的主要貢獻(xiàn)者，但有證據(jù)表明，焓可以起關(guān)鍵作用，特別是在增強(qiáng)了孔內(nèi)可用靜電相互作用的改性系統(tǒng)中。分離熱力學(xué)組分的一種成功方法是用弱相互作用的陽離子（如Li＋）代替弱相互作用的陽離子（如K＋）。但是，更直接的方法是測(cè)量聚合物-納米孔動(dòng)力學(xué)隨溫度變化的函數(shù)，以構(gòu)建Arrhenius圖，從中可以明確地提取焓和熵。盡管可以通過紅外燈或密封的Peltier裝置對(duì)納米孔裝置進(jìn)行溫度控制，但是這些實(shí)驗(yàn)的繁瑣和緩慢的特性（即，溫度在每分鐘時(shí)間尺度上的變化）將詳細(xì)的熱學(xué)研究的數(shù)量限制為僅幾個(gè)示例。

為了克服靜態(tài)外部溫度控制方法的挑戰(zhàn)，來自弗吉尼亞聯(lián)邦大學(xué)和國家標(biāo)準(zhǔn)與技術(shù)研究所 (NIST) 的研究人員使用了基于激光的加熱方法，該方法可以動(dòng)態(tài)控制局部溫度?？梢酝ㄟ^用紅外光直接激發(fā)水中的振動(dòng)模式或通過納米等離子輔助加熱以及半導(dǎo)體材料中電子模式的激發(fā)（間接）來實(shí)現(xiàn)光學(xué)加熱。

該團(tuán)隊(duì)通過制造形成細(xì)胞膜的生物材料的人工版本來構(gòu)建其生物傳感器。它被稱為脂質(zhì)雙層，它包含一個(gè)直徑約2納米（十億分之一米）的細(xì)小孔，周圍被流體包圍。溶解在流體中的離子穿過納米孔，產(chǎn)生小的電流。但是，當(dāng)將感興趣的分子驅(qū)動(dòng)到膜中時(shí)，它會(huì)部分阻止電流流動(dòng)。這種封鎖的持續(xù)時(shí)間和大小可作為指紋，識(shí)別特定分子的大小和性質(zhì)。為了對(duì)大量的單個(gè)分子進(jìn)行準(zhǔn)確的測(cè)量，目標(biāo)分子必須在納米孔中停留的時(shí)間既不能太長也不能太短（“ Goldilocks”時(shí)間），范圍從百萬分之一秒到十分之一秒。問題在于，如果納米孔以某種方式將它們固定在適當(dāng)?shù)奈恢?，則大多數(shù)分子僅在此時(shí)間間隔內(nèi)停留在納米孔的小體積中。這意味著納米孔環(huán)境必須提供一定的屏障，例如增加靜電力或改變納米孔的形狀，這會(huì)使分子更難以逃脫。對(duì)于每種類型的分子，突破障礙所需的最小能量各不相同，這對(duì)于生物傳感器高效，準(zhǔn)確地工作至關(guān)重要。計(jì)算該數(shù)量涉及測(cè)量與分子進(jìn)入和移出孔時(shí)的分子能量有關(guān)的幾個(gè)屬性。至關(guān)重要的是，目標(biāo)是測(cè)量分子與周圍環(huán)境之間的相互作用主要是由化學(xué)鍵還是由分子在捕獲和釋放過程中擺動(dòng)和自由移動(dòng)的能力引起的。

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▲圖1. 實(shí)驗(yàn)裝置圖和相應(yīng)的加熱軌跡。

(A) 實(shí)驗(yàn)裝置的示意圖。(B) PEG28與納米孔相互作用的典型電流跡線，作為Au-簇的分隔物，進(jìn)入和流出αHL的前庭。(C) 和 (D) 分別顯示了PEG28和AT1的溫度校準(zhǔn)電流，因?yàn)榫酆衔锱c開孔相互作用。電流（和溫度）由紅外激光通過一個(gè)振蕩周期進(jìn)行調(diào)制。(E) 在24°C下顯示Au-簇（實(shí)心正方形）和開孔（空心正方形）構(gòu)型的PEG-αHL停留時(shí)間分布。(F) AT1-αHL的停留時(shí)間分布顯示為在24°C下具有Au簇（實(shí)心正方形）和開孔（空心正方形）構(gòu)型。顯示的數(shù)據(jù)是在70 mV施加跨膜電勢(shì)下在3 M KCl中收集的。在所有實(shí)驗(yàn)中，接地電壓均參考孔的反面。(E) 和 (F) 中的誤差線是根據(jù)計(jì)算為計(jì)數(shù)平方根的1 SD估算的。

到目前為止，由于多種技術(shù)原因，缺少用于提取這些高能成分的可靠測(cè)量方法。在這項(xiàng)新研究中，由NIST的Joseph Robertson和VCU的Joseph Reiner共同領(lǐng)導(dǎo)的一個(gè)團(tuán)隊(duì)證明了使用基于激光的快速加熱方法測(cè)量這些能量的能力。

圖2說明了激光驅(qū)動(dòng)溫度控制（動(dòng)態(tài)控制）的優(yōu)點(diǎn)； 在基于激光的加熱條件下觀察到了AT1，并將其與使用靜態(tài)珀?duì)柼刂茰囟瓤刂频念愃茖?shí)驗(yàn)進(jìn)行了比較。進(jìn)行比較的目的是確?；趧?dòng)態(tài)激光的溫度調(diào)制不會(huì)產(chǎn)生任何意外的系統(tǒng)偏差?；诩す獾募訜崤c整體溶液加熱之間的協(xié)議表明，激光加熱器不會(huì)將雜散偽像（即通過對(duì)流或輻射傳遞）引入系統(tǒng)。研究人員注意到，由于數(shù)據(jù)收集（包括點(diǎn)之間的溫度平衡）需要30分鐘以上的時(shí)間才能生成包含三個(gè)離散數(shù)據(jù)點(diǎn)的數(shù)據(jù)集，因此通常無法進(jìn)行重復(fù)的體溫測(cè)量。

▲圖2. 整體加熱和基于激光的加熱的Arrhenius圖的比較。

通過基于激光的動(dòng)態(tài)加熱（空心符號(hào)，三個(gè)不同的孔）和基于珀?duì)柼拇罅考訜幔▽?shí)心黑圈，一個(gè)孔）產(chǎn)生的阿倫尼烏斯圖顯示了方法之間的一致性。實(shí)線是對(duì)每個(gè)數(shù)據(jù)集的最小二乘線性擬合。靜態(tài)加熱條件對(duì)應(yīng)于通過嵌入分析室中的PID控制的Peltier設(shè)備進(jìn)行的溫度控制。動(dòng)態(tài)加熱條件對(duì)應(yīng)于通過AOM調(diào)制的1444 nm激光器進(jìn)行的溫度控制。靜態(tài)實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生了三個(gè)離散溫度。靜態(tài)數(shù)據(jù)集的誤差線是根據(jù)觀察到的停留時(shí)間的標(biāo)準(zhǔn)偏差估算的。代表性數(shù)據(jù)來自AT1在70 mV和3 M KCl（pH 7.2）中的數(shù)據(jù)。

測(cè)量必須在不同的溫度下進(jìn)行，并且激光加熱系統(tǒng)可確保這些溫度變化快速且可重復(fù)地發(fā)生。這使研究人員可以在不到2分鐘的時(shí)間內(nèi)完成測(cè)量，而原本需要30分鐘或更長時(shí)間。沒有這種新型的基于激光的加熱工具，他們的經(jīng)驗(yàn)表明，根本無法進(jìn)行測(cè)量。因?yàn)樗鼈儗⒓群臅r(shí)又昂貴。實(shí)質(zhì)上，研究人員已經(jīng)開發(fā)了一種工具，可以改變納米孔傳感器的開發(fā)流程，以迅速減少涉及傳感器發(fā)現(xiàn)的猜測(cè)。

進(jìn)行能量測(cè)量后，它們可以幫助揭示分子如何與納米孔相互作用。然后，科學(xué)家可以使用此信息來確定檢測(cè)分子的最佳策略。

例如，考慮一個(gè)主要通過化學(xué)相互作用（基本上是靜電相互作用）與納米孔相互作用的分子。為了達(dá)到Goldilocks的捕獲時(shí)間，研究人員進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)，對(duì)納米孔進(jìn)行了修飾，以使其對(duì)目標(biāo)分子的靜電吸引既不太強(qiáng)也不太弱。出于這一目標(biāo)，研究人員用兩個(gè)小肽，即構(gòu)成蛋白質(zhì)構(gòu)建基團(tuán)的化合物的短鏈，展示了該方法。其中一種肽，血管緊張素可穩(wěn)定血壓。另一種肽，神經(jīng)降壓素，有助于調(diào)節(jié)多巴胺，多巴胺是一種影響情緒的神經(jīng)遞質(zhì)，在大腸癌中也可能起作用。這些分子主要通過靜電力與納米孔相互作用。研究人員將納米顆粒中的金納米顆粒插入了帶電材料，從而增強(qiáng)了與分子之間的靜電相互作用。

研究小組還研究了另一種分子，聚乙二醇，其移動(dòng)能力決定了它在納米孔中花費(fèi)了多少時(shí)間。通常，該分子可以不受環(huán)境的束縛而自由擺動(dòng)，旋轉(zhuǎn)和伸展。為了增加分子在納米孔中的停留時(shí)間，研究人員改變了納米孔的形狀，使分子更難以擠過微小的空腔并退出。

研究人員可以利用這些變化來構(gòu)建適合檢測(cè)特定分子的納米孔生物傳感器。最終，研究實(shí)驗(yàn)室可以使用這種生物傳感器來識(shí)別感興趣的生物分子，或者醫(yī)生辦公室可以使用該設(shè)備來識(shí)別疾病的標(biāo)記。

本文來源：Christopher E. Angevine et al, Laser-based temperature control to study the roles of entropy and enthalpy in polymer-nanopore interactions, Science Advances (2021). DOI: 10.1126/sciadv.abf5462